Taq DNA polymerase (Hebrew)

From Proteopedia

(טאק פולימראז) Taq DNA Polymerase

רקע

Taq Polymerase (טאק פולימראז) הוא דנ"א פולימראז שעמיד בחום, הנקרא על שם החיידק התרמופילי Thermus aquaticus. האנזים בודד לראשונה מהחיידק Thermus aquaticus על ידי Thomas D. Brock ב-1965. ב-PCR, שיטה המשמשת להגברת מקטעים קטנים של דנ"א, משתמשים לעיתים קרובות בטאק פולימראז.

תפקוד החלבון

כהכנה לקראת חלוקת התא מתרחשת הכפלה של הדנ"א. תפקידו של הדנ"א פולימראז הוא לאפשר את היצירה של מולקולות דנ"א מנוקליאוטידים בודדים על בסיס תבנית דנ"א קיים, ובאופן זה מתבצעת ההכפלה. תהליך זה הכרחי לכל היצורים החיים, ולכן כל היצורים החיים מכילים צורה כלשהי של דנ"א פולימראז. קיימים מספר סוגים של דנ"א פולימראז ולחלקם יש פעילות אקסונוקלאזית, כלומר הם יכולים לחתוך נוקלאוטידים מגדיל דנ"א. דבר זה שימושי בתהליכי תיקון טעויות (proofreading) במהלך הכפלת הדנ"א. לטאק פולימראז אין פעילות של אקסונוקלאז מ-'3 ל-'5, אבל יש לו יכולת אקסונוקלאזית מ-'5 ל-'3, שמנוצלת עבור חיתוך תחלים של מקטעי אוקזאקי.

מבנה החלבון

טאק דנ"א פולימראז הוא חלבון המורכב מ-832 (כל סוג של חומצה אמינית מסומן בצבע אחר), המהוות את ההמבנה הראשוני שלו ומשקלו המולקולארי 94 קילו דלתון. המבנה השניוני של החלבון מורכב (סלילי אלפא מסומנים בורוד ומשטחי בטא מסומנים בצהוב). הוא מורכב (מסומנת בצבע חום), כלומר ללא מבנה רבעוני (להרחבה על מבנה רבעוני ניתן לעיין בדף העבודה המצורף בתחתית הערך).

לטאק דנ"א פולימראז (המסומנים כל אחד בצבע שונה) הנבדלים זה מזה בפעילותם הביולוגית:

1) (מסומן בצבע ורוד) בעל פעילות אקסונוקלאזית מ-'5 ל-'3 (מורכב מחומצות אמינו 1-290). בתוך המתחם הזה ישנם עשר חומצות אמינו שמורות בעלות שייר חומצי, והן: אספרטט בעמדה 18, 67, 119, 120, 142, 144, 188 ו-191 ; גלוטמט בעמדה 76 ו-117. העמדות 18, 119 ו-142 מהוות (Zn+2) (אתר הקישור מסומן בירוק והאבץ באדום). העמדות 142, 144 מהוות אחד (Mg+2) (אתר הקישור מסומן בסגול), והעמדות 116, 117 ו-120 מהוות שני (Mg+2) (אתר הקישור מסומן באדום). הקישור ליונים הללו נחוץ לפעילות תקינה של החלבון.

2) (מסומן בצבע ירוק) המורכב מחומצות אמינו 291-423. מתחם זה דומה במבנהו למתחם מקביל בדנ"א פולימראז של החיידק אי-קולי. ההבדל בין שני המתחמים, הוא שאצל הראשון (טאק) חסרות מספר חומצות אמינו לעומת השני. הבדל זה כנראה הוא גם הסיבה לכך שלפולימראז של החיידק אי-קולי קיימת יכולת אקסונוקלאזית מ-'3 ל-'5, מה שכאמור לא קיים בטאק פולמיראז. כתוצאה מכך אין לו יכולת תיקון טעויות. בנוסף, טאק פולימראז מייצר טעויות בהחלפת בסיס בקצב של טעות אחת ל-9000 נוקלאוטידים שמסונתזים. לכן בצירוף שני הנתונים הללו אמינות השכפול שלו נחשבת נמוכה יחסית.

3) (מסומן בצבע כחול ומורכב מחומצות אמינו 424-832) האחראי להכניס נוקלאוטידים חדשים לתוך גדיל הדנ"א הנבנה. צורתו המרחבית יוצרת מעין "יד אדם פתוחה", הכוללת "אגודל", "אצבעות" ו"כף היד". ה"אגודל", ה"אצבעות" ו"כף היד" יוצרים כיס שהדנ"א יכול לזוז לאורכו. מולקולת הדנ"א באה באינטראקציה עם מס' חומצות אמינו הממוקמות ב ("כף היד" מסומנת בסגול והדנ"א בירוק). חומצות אמינו אלה הן שמורות אבולוציונית ומהוות את (המסומן בצבע כתום) של מתחם הפולימראז. ה"יד הפתוחה" של הטאק פולימראז, עוטפת את גדיל הדנ"א, דבר המביא בעקבותיו שינוי מרחבי ובעקבות כך הוספת בסיסים לגדיל הדנ"א הנבנה. (בסרטון רואים דנ"א דו גדילי: גדיל אחד צבוע בתכלת והשני באפור. בנוסף רואים נוקלאוטיד שמגיע הצבוע בצבע אפור. הסרטון מתאר את התהליך בו נוסף הנוקלאוטיד לגדיל הדנ"א בתוך מתחם הפולימראז). מתחם זה ממוקם בקצה הקרבוקסילי של האנזים, ומעניין לציין כי קיימת זהות של 51% מחומצות האמינו למקטע המקביל שלו בדנ"א פולימראז של החיידק אי-קולי. בהשוואת מבנה מתחם זה למתחם פולימראז מהחיידק אי-קולי, טאק פולימראז מכיל ארבעה קשרי מימן נוספים ושני גשרי מלח (קשרים יוניים) נוספים. ייתכן, ושוני מבני זה מקנה לטאק פולימראז את יכולת העמידות בטמפרטורת גבוהות.

PCR-השימוש בחלבון ב

Thermus aquaticus הוא חיידק שחי במעיינות חמים, ובהתאם אנזים השכפול שלו טאק פולימראז עמיד לתנאי הדנטורציה של הדנ"א (טמפרטורות גבוהות) שנדרשים במהלך ה-PCR. האנזים החליף את הדנ"א פולימראז מהחיידק אי-קולי שהשתמשו בו במקור ב-PCR. הטמפרטורה המיטבית (אופטימאלית) עבור פעילות של טאק היא 72-75 מעלות צלזיוס, עם יכולת שכפול של 1000 נוקליאוטידים של דנ"א בפחות מ-10 דקות ב-72 מעלות צלזיוס. טאק יציב בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה שנדרשת עבור דנטורציה של סליל דנ"א (כלומר, ניתוק קשרי המימן בין 2 גדילי הדנ"א ויצירת דנ"א חד גדילי). משתמשים בטאק באופן נרחב ב-PCR (פרוצדורה של הגברת מקטעי דנ"א), וזאת בשל העמידות שלו לחום. תכונה זו של האנזים מאפשרת להוסיפו רק פעם אחת בתחילת תהליך ה-PCR. לסיכום, טאק פולימראז הוא כלי בעל ערך בתחום הביולוגיה המולקולארית, בשל היותו מרכיב מפתח בתהליך ה-PCR.

דף עבודה

דף עבודה בנושא טאק פולימראז

מקורות

טאק דנ"א פולימראז במאגר מבני החלבונים PDB
מידע על החלבון במאגר NCBI

Kim, Y., & Eom, S.H., & Wang, J., & Lee, D.S., & Suh, S.W., & Steitz, T.A. (1995) Crystal structure of Thermus acquaticus DNA polymerase. Nature 376: 612-616