Alkaline phosphatase (Hebrew)

From Proteopedia

(Alkaline phosphatase- ALP) אלקליין פוספטאז

החלבון אלקליין פוספטאז משתייך לקבוצת הפוספטאזות. פוספטאזות הם אנזימים המזרזים הסרת קבוצת פוספט (דה-פוספורילציה) ממולקולות אורגניות בתהליך הידרוליזה , כלומר פירוק קשר הפוספט נעשה תוך תגובה עם מולקולת מים.
פעולת הפוספטאז הינה הפעולה ההפוכה מזו של הקינאז המוסיף קבוצת פוספט למולקולות שונות (פוספורילציה).
הפוספטאזות מתחלקות לפוספטאזות חומציות ובסיסיות בהתאם לרמת הpH בה מתרחשת פעילות אופטימלית של האנזים. פעילותו של אלקליין פוספטאז, הקרוי גם פוספטאזה בסיסית, מתבצעת ברמת pH בין 8 ל 10, כתלות באורגניזם שממנו בודד האנזים.
האורגניזם ממנו בודד האנזים המוצג בערך זה הוא Escherichia coli.
פעילותו של האלקליין פוספטאז היא בלתי ספציפית, כלומר הינו בעל יכולת לבצע דה פוספורילציה למגוון מולקולות- לנוקליאוטידים וחלבונים שונים.

מבנה המולקולה

האנזים הוא הומודימר ובנוי משתי יחידות חלבוניות הנקראות גם "שרשראות חלבוניות". שתי היחידות באלקליין פוספטאז הן .
של החלבון כולל סלילי אלפא (המוצגים בצבע ורוד) ומשטחי בטא (המוצגים בצבע צהוב).
כל יחידה מורכבת משרשרת חלבונית שאורכה 471 חומצות אמינו, כאשר 21 החומצות האמיניות שבקצה ה-N טרמינלי של החלבון מהוות פפטיד-סיגנל, שלא נכלל בתצוגת החלבון. שאר הרצף, הכולל את הבאות, מרכיב את השרשרת החלבונית. בתצוגה, כל חומצה אמינית מיוצגת ככדור צבעוני (כל חומצה אמינית בצבע שונה). תת היחידה המוצגת בצבעים היא תת יחידה B, בעוד שתת יחידה A מוצגת בצבע לבן.
פפטיד-סיגנל הינו רצף חומצות אמינו הקיים בחלבונים ממברנליים ומזוהה על ידי חלבון ייחודי (SRP) שעוצר את התרגום ומוביל את החלבון הנוצר אל הרשת האנדופלסמטית- ER להמשך תרגום, ומשם יועבר החלבון למיקומו בממברנת התא או להפרשה מחוץ לתא.
המבנה המרחבי של החלבון כולל בכל תת-יחידה. קשר דיסולפידי (קשר S-S) הינו קשר קוולנטי הנוצר בין שני אטומי גופרית הנמצאים בשייר של חומצות אמינו ציסטאין. במידה וחומצות האמינו סמוכות אחת לשנייה יווצר הקשר. קשרים דיסולפידיים תורמים ליצירת המבנה השלישוני של החלבון ומקנים יציבות למבנה המרחבי.

, המצוי בכל אחת מתתי היחידות, כולל חומצה אמינית יחידה, החומצה האמינית סרין, בעלת פעילות קטליטית. חומצה אמינית זו מצויה בעמדה 102 בשרשרת החלבונית (ללא הפפטיד-סיגנל).
כיס האתר הפעיל מכיל גם יון מגנזיום ושני יוני אבץ הנקשרים לחומצות אמינו סמוכות. חומצות האמינו הללו, כמו גם הסרין המצויה בעמדת האתר הקטליטי וחומצות האמינו המשתתפות בקשרים הדי-סולפידיים, מצויות ב.
מבנה החלבון המוצג בעמוד זה מציג כאמור אלקליין פוספטאז שמקורו בחיידק אי-קולי, בהשוואת הרצף של חלבון זה לרצפים של אלקליין פוספטאז שבודדו מאורגניזמים אחרים אותרו העמדות השמורות, עמדות מקבילות שבהן יש חומצות אמינו זהות. חלק מהעמדות הללו שמורות הן באנזים ממקור אאקריוטי והן באנזים ממקור פרוקריוטי (מסומנות בורוד+ סרין בטורקיז) וחלקן שמורות רק בפרוקריוטים (מסומנות בצהוב). עובדה זו מתאימה לכך שעמדות שמורות של חומצות אמינו בעלות חשיבות מבנית ותפקודית מעידות על קירבה פילוגנטית בין האורגניזמים שמהם בודד החלבון, שכן חיידקי האי-קולי שמהם בודד החלבון קרובים אבולוציונית לפרוקריוטים אחרים יותר מאשר לאורגניזמים אאוקריוטים ועל כן יש ביניהם יותר דמיון.

פעילות קטליטית

האנזים אלקליין פוספטאז מסיר קבוצות פוספאט ממולקולות מזורחנות וכתוצאה מכך נוצרת מולקולה כהלית וקבוצת פוספט חופשית.

יון מגנזיום ושני יוני אבץ משמשים כקו-פקטורים הנדרשים לצורך יציבות ופעילות של האנזים. האנזים , הפועל כמעכב תחרותי החוסם את הכיס הקטליטי מקשירת סובסטרט.

אלקליין פוספטאז בגוף האדם

ברקמות שונות בגוף ישנן צורות שונות, איזואנזימים שונים של אלקליין פוספטאז, הנבדלים ביניהם במספר מדדים, כולל הבדלים במשקלם המולקולארי שנע בין 70 ל-120 קילודלטון.
ברקמות שונות בגוף, רמת הביטוי של איזואנזימים שונים, שונה. הרקמות העיקריות בהן נמצאה פעילות משמעותית של אלקליין פוספטאז הן: כבד, עצמות השלד, שליה, מעיים, כליות, טחול וריאות.
רמת אלקליין פוספטאז בדם מוערכת בבדיקות סקר וניתן באמצעות מדד זה לבדוק תפקודי כבד ולאבחן מחלת כבד, מפגעי עצמות או חסימות בדרכי המרה. כאשר יש פגיעה בתאים, משתחרר מהם האנזים ורמתו בדם עולה. כאשר יש עליה ברמת אלקליין פוספטאז בדם, מדידת האיזואנזימים השונים יכולה להצביע על האיבר הנפגע שממנו השתחרר האנזים. אנזים זה מעורב גם בבניית העצם, כך שגם בתהליך גדילה יש עליה של רמת האנזים בדם.
האנזים מקובע בקצה ה-C טרמינלי לממברנות התאים בהם הוא מתבטא. בעקבות הוספת פוספט לחלבון מטרה (באמצעות קינאז) או הסרתו (באמצעות פוספטאזה), מתרחש מעבר של חלבון המטרה ממצב פעיל למצב לא פעיל, ולהיפך. כיוון שכך, פעילותו של האנזים בהסרת פוספט מחלבונים שונים משפיעה על שפעול תהליכים שונים בתא.

אלקליין פוספטאז במחקר

אלקליין פוספטאז משמש במעבדה להסרת פוספט ממולקולות שונות. כך למשל, על מנת להחדיר מקטעי דנ"א שונים לתוך פלסמידים (תהליך הקרוי שיבוט) לצורכי הנדסה גנטית בחיידקים, נעשה שימוש באלקליין פוספטאז. לשם כך, מבצעים חיתוך של הפלסמיד באתר שבו מעוניינים להחדיר את מקטע הדנ"א הרצוי (המחדר).
לאחר מכן, על מנת להבטיח שאחוז גבוה של הפלסמידים החתוכים יקלטו את המחדר, מוסיפים אלקליין פוספטאז לתמיסה המכילה את הפלסמידים החתוכים (מקטעים ליניאריים) והאנזים אלקליין פוספטאז מסיר קבוצות פוספאט מהקצוות של הפלסמיד החתוך (מהנוקליאוטיד שבקצה ה-5').
כתוצאה מכך, כאשר יעורבבו מולקולות הפלסמיד שטופלו באלקליין פוספטאז עם המחדרים, בתוספת האנזים ליגאז, תתאפשר סגירה של מולקולת הפלסמיד לצורתה המעגלית רק בתוספת המחדר המכיל בקצהו את קבוצת הפוספט הנדרשת ליצירת הקשר הפוספודיאסטרי בין הנוקליאוטידים על ידי הליגאז. להלן סרטון הממחיש את התהליך.

שימוש נפוץ נוסף באלקליין פוספטאז במעבדה הוא לצורך קביעת רמת ביטוי של גן נחקר. הגן phoA, שמקורו ב- Escherichia coli, מקודד לאלקליין פוספטאז ומשמש במחקר כגן מדווח המוחדר לתאים בשיטות של הנדסה גנטית. יכולתו של האנזים להקשר ולהסיר פוספט מטווח רחב של חומרים, מאפשרת למדוד את פעילותו על ידי שימוש בסובסטרטים שונים המשנים את אופיים לאחר הסרת הפוספט.
הסיגנל הנמדד לפעילות משתנה בהתאם לסובסטרט- הסיגנל יכול להיות אלקטרוכימי, כולורימטרי ,פלורסנטי ועוד.
כך למשל סיגנל כולורמטרי מתקבל בנוכחות הסובסטרט pNPP: p-nitrophenyl phosphate . בעקבות הפעילות האנזימטית, מתקבל התוצר p-nitrophenol שהינו חומר בצבע צהוב שניתן למדוד את עוצמת הבליעה שלו המעידה על רמת הביטוי של הגן phoA.
כאשר הגן phoA מוחדר לתא בסמוך לגן נחקר או לאזור הבקרה של גן נחקר, רמת הביטוי מעידה על מידת ביטוי הגן הנחקר בתנאים הנבדקים.

פירוק הסובסטרט חסר הצבע, לתוצר צבעוני על ידי אלקליין פוספטאז

תרגול

דף עבודה לתלמיד